Возрастающее число мультирезистентных штаммов Mycobacterium tuberculosis представляет собой серьезную проблему для современного здравоохранения. Лечение пациентов, инфицированных мультирезистентными штаммами, требует применения более токсичных и дорогостоящих химиопрепаратов, длительной госпитализации и, тем не менее, часто остается неэффективным, обуславливая высокий удельный вес инвалидизации и смертности.
Основным в решении этой проблемы является своевременная детекция мультирезистентных штаммов на ранних стадиях заболевания, которая позволит контролировать дальнейшее распространение конкретного выявленного штамма и подобрать оптимальную схему химиотерапии. Тем не менее, определение спектра лекарственной резистентности классическими методами на селекционных средах занимает от 3-х недель до 3-х месяцев, что делает полученный результат ретроспективным.
Альтернативным и более перспективным вариантом решения этой проблемы является использование генотипических методов анализа, основанных на выявлении точечных мутаций или других генетических детерминант, обеспечивающих резистентность к антибиотикам. Этот подход стал возможным благодаря определенному успеху в исследовании молекулярных основ резистентности Mycobacterium tuberculosis к таким противотуберкулезным препаратам, как рифампицин [Telenti A.,1993.), изониазид (Sherman DR, 1996.), фторхинолоны (Takiff H. E, et al., 1994), стрептомицин (Heym B., 1994.) и канамицин (Suzuki Y., 1998.). Его отличительной чертой является небольшой срок выполнения анализа, составляющий 2-3 дня.
Рифампицин является одним из основных туберкулостатиков, что обуславливает высокий удельный вес резистентных к нему штаммов. Актуальность выявления резистентности к рифампицину обусловлена тем, что до 80 - 90% рифампицин-резистентных клинических штаммов Mycobacterium tuberculosis устойчивы и к изониазиду, что позволяет считать рифампицин-резистентные штаммы своеобразным косвенным \"маркером\" мультирезистентности (Heym B.et.al., 1994).
Около 95% резистентных к рифампицину штаммов Mycobacterium tuberculosis содержат точечные мутации, делеции или вставки в гене rpoB, кодирующем b - субъединицу РНК-полимеразы. Современные методы генодиагностики резистентности к рифампицину основаны на детекции мутаций, большая часть которых компактно локализована в высоко консервативной области rpoB гена (Telenti A. Et.al., 1993).
Следует отметить, что эффективность такого подхода для детекции резистентных штаммов во многом зависит от того, насколько полно исследованы и охарактеризованы ассоциированные с резистентностью мутации. Считается, что тип и частота встречаемости определенных мутаций в rpoB гене достаточно консервативны среди микобактериальных штаммов, распространенных в различных географических районах. В то же время, в ряде исследований была отмечена и определенная географическая вариабельность таких мутаций (Rinder H.et.al. , 1997). К сожалению, штаммы, выявляемые на территории Российской Федерации и стран СНГ, в этом отношении остаются пока малоисследованными.
В целом, с учетом изложенного, прямое секвенирование ПЦР фрагментов rpoB гена выглядит наиболее универсальным генотипическим методом детекции резистентности к рифампицину. Наибольшая информативность такого подхода позволяет максимально полно охарактеризовать весь спектр возможных мутаций и правильно оценить резистентность исследуемых штаммов, а в ряде случаев и их эпидемиологические особенности. Немаловажно, что при большей информативности по сравнению с другими методами себестоимость одного анализа путем прямого секвенирования ниже, чем при использовании набора INNO-LiPA Rif.TB и составляет $3. С технической точки зрения, анализы такого типа можно проводить в специально оборудованных лабораториях противотуберкулезных диспансеров республиканского, краевого и областного подчинения.
Как диагностический прием прямое секвенирование применимо и для выявления резистентности Mycobacterium tuberculosis к другим противотуберкулезным препаратам. Внедрение молекулярно-биологических методов диагностики, основанных на применении полимеразной цепной реакции, значительно повышает эффективность выявления микобактерий туберкулезного комплекса по сравнению с традиционными микробиологическими методами (бактериоскопия, люминесцентная микроскопия, посев). При туберкулезе органов дыхания преимущество ПЦР наиболее ощутимо при недеструктивных и ограниченных формах болезни. При внелегочных формах болезни, характеризующихся олигобациллярностью, более адекватной диагностике будут способствовать использование различных способов выделения ДНК, одновременное исследование различных по характеру биологических образцов от одного больного и применение туберкулино-провокационных проб.
Сочетание молекулярных методов типирования микобактерий туберкулеза с методами прямой детекции (секвенирование) резистентности к химиопрепаратам позволит в дальнейшем проводить не толькостатистические мониторинговые эпидемиологические исследования, но и получать достоверные результаты в клинически значимом масштабе времени. (Бочкарёв Е.Г. и др., 2000). (Более подробно см. Skarlatos S.I.,Vellerti P.A., Morris M., Davies P. NEW VISTAS IN THERAPEUTICS: FROM DRUG DESIGN TO GENE THERAPY.
Annals of the New York Academy of Sciences.V.953,dec. 2001.)
Использование гибридизационных технологий открывает новые перспективы генодиагностики вирусных гепатитов В и С. Количественные методики оценки вируса, основанные на детекции продуктов ПЦР реакции путем гибридизации с внутреннем зондом, станут более простыми и общедоступными. Для детекции генетических изменений, встречающихся в популяции вирусов В и С (НВе негативные мутанты ВГВ и генотипы ВГС) возможно использование принципа обратной гибридизации с типоспецифичным зондом. Реализация этих возможностей позволит создать первые отечественные тест-системы для типирования вирусов В и С.(Ильина Е.Н. и др.2000).
Благодаря методу ПЦР, стало возможным выявлять не только ДНК вируса гепатита В, но и определять фрагменты генома вируса, в которых произошла мутация. Так, например, оказалось что НBe – негативный хронический гепатит В (при котором не выявляется HBe Ag) – это мутант вируса гепатита В, у которого мутация произошла в области кодирующей HBeAg (precore мутантный вариант), и инфекция этим вариантом вируса имеет свою клиническую картину. HBe негативный хронический гепатит В имеет больший циррозогенный потенциал и менее эффективно лечится. Открытие мутаций в зоне кодирующей HBsAg, показало, что современная вакцина не сможет предупредить инфекцию этим вариантом вируса (HBV “S” вариант). У небольшого процента больных хроническим гепатитом В вообще не выявляется HBsAg, что, возможно, тоже связано с мутационным процессом, и арбитражным методом диагностики в данном случае является выявление ДНК вируса гепатита В в сыворотке крови. Молекулярно-биологические методы изучения мутационного процесса позволили показать, что возможно как первичное заражение мутантным вариантом вируса гепатита В, так и инфицирование “диким” вариантом с последующей мутацией его в процессе длительной персистенции вируса в организме человека.
С момента внедрения этого метода в клиническую практику прошло не многим более 5 лет, а диагностические возможности этого метода продолжают расширяться и позволяют нам лучше понять патогенез заболевания и разрабатывать новые методы лечения.

РНК-ПЦР пока является единственным высокочувствительным методом диагностики острого гепатита С и обнаружения больных серонегативным хроническим гепатитом С. РНК-ПЦР дает возможность провести генотипирование ВГС и количественную оценку уровня виремии, что позволяет выбрать наиболее благоприятный момент для начала противовирусной терапии и прогнозировать ее исход. С помощью РНК-ПЦР можно обнаружить репликацию ВГС, установить этиологическую и патогенетическую роль ВГС в различных внепеченочных синдромах. Упрощение, стандартизация и, возможно, автоматизация этого метода позволят использовать его при исследовании донорской крови и трансплантируемых органов.
Метод ПЦР используется для постановки и/или подтверждения диагноза, контроля терапии в акушерско-гинекологической практике, неонатологии, педиатрии, урологии, венерологии, нефрологии, гепатологии, пульмонологии, офтальмологии, неврологии, фтизиатрии и др.
Открывается перспектива щирокого применения ПЦР для диагностики цитомегало- и герпес-вирусной инфекции, дифтерии, хеликобактериоза, хламидиоза, бруцеллеза, и других инфекций. При ВИЧ инфекции использование ПЦР диагностики позволяет выявлять инфекцию на ранних её этапах, до сероконверсии, что очень важно при проверке переливаемой крови. Метод ПЦР перспективен при диагностике гепатита С, проверке крови доноров. Ранняя исчерпывающая полная диагностика создает предпосылки для оперативного проведения противоэпидемических и профилактических мероприятий.